Tesis doctoral del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Área de conocimiento de Genómica y proteómicA
PARTE I. Esta tesis versa sobre el estudio del enzima N-acetil-L-glutamato quinasa (NAGK), no regulado por arginina, de la enterobacteria Escherichia coli. Este enzima cataliza la transferencia del fosfato terminal del ATP al N-acetil-L-glutamato (NAG) en el segundo paso de la ruta de síntesis de arginina en microorganismos y plantas. En el desarrollo de esta tesis doctoral hemos clonado el gen que codifica para la NAGK de E. coli en un vector plasmídico adecuado, hemos sobreexpresado el enzima y lo hemos purificado en un grado muy elevado. Además, se ha conseguido cristalizar el enzima obteniendo varios complejos cristalinos tanto en su forma libre de sustratos como en presencia de varios ligandos, que incluyen sustratos y análogos de los sustratos. El empleo de técnicas de cristalografía de rayos X sobre los cristales obtenidos han permitido determinar las estructuras del complejo del enzima con MgAMPPNP y NAG a 1.5 Å de resolución y las de los complejos con MgADP y NAG con o sin tetrafluoruro de aluminio interpuesto, o de ADP y sulfato, todos ellos a una resolución de 1.9 Å. Todas las estructuras concuerdan en un mismo plegamiento básico, constituido por un homodímero nucleado por una hoja b molecular central de 16 elementos, rodeado de dos capas de hélices a, con bucles y dos hélices emergiendo del borde C-terminal de la hoja b central de cada subunidad, formando dichos bucles los sitios de unión de los sustratos. La estructura concuerda en su mayor parte con la descrita previamente por el laboratorio para la carbamato quinasa (CK), pudiendo constituir la NAGK el paradigma para los demás enzimas de la familia aminoácido quinasa. La presencia en la NAGK de NAG unido permite la caracterización por primera vez del sitio de unión del sustrato a fosforilar en estos enzimas. Además, los diferentes complejos han permitido dilucidar el modo de unión del nucleótido y establecer las bases de la especificidad para el mismo, de la catálisis, así como el curso del grupo fosforilo desde los sustratos a los productos. La comparación con la CK revela un mismo modo de unión de nucleótido a ambos enzimas. Los complejos con MgAMPPNP-NAG y con MgADP-tetrafluoruro de aluminio-NAG revelan que la transferencia de fosforilo sucede en un sólo paso, en línea, con carácter asociativo y con formación de un intermediario pentavalente bipiramidal. Las cargas positivas de dos lisinas conservadas, los extremos N-terminales de dos hélices a y la formación de una red de puentes de hidrógeno del fosfato que se transfiere con la proteína, son elementos catalíticos clave. Un aspartato conservado, tres moléculas fijas de agua y el catión metálico divalente parecen elementos adicionales clave en la organización del centro activo. El centro activo comprime los sustratos en la dirección del intermediario o estado de transición, proponiéndose que la complementariedad del enzima con dicho intermediario estabiliza este último y es un elemento catalítico clave con este enzima. Se propone también que el centro activo sufre fuertes cambios conformacionales con la unión de los sustratos, y que parte de la energía de dicha unión de los sustratos se utiliza para la generación de la conformación catalíticamente productiva.
PARTE II. La presencia de una molécula de AMPPNP unida periféricamente al enzima, muy extendida, no acomplejada con Mg2+, nos informa acerca de la conformación que adopta el nucleótido en solución o en sus colisiones con moléculas de proteína. La hipótesis de que este nucleótido tenga importancia funcional para la reacción de la NAGK no parece apoyada por la ausencia del nucleótido periférico en los demás complejos. Por último, se han iniciado los estudios para la caracterización de las bases moleculares de la inhibición "feed-back" de la NAGK por arginina, mediante la cristalización de la NAGK de Pseudomonas aeruginosa, que a diferencia del enzima de E. coli, está sometida a este tipo de inhibición.
PART I. N-acetyl-L-glutamate kinase (NAGK) catalyzes the second step of microbial arginine biosynthesis. The gene for Escherichia coli NAGK was cloned and expressed in E. coli, allowing enzyme purification and crystallization with and without substrates. The E. coli NAGK crystal structure to 1.5 Å resolution reveals a 258-residue subunit homodimer nucleated by a central 16-stranded molecular open _-sheet sandwiched between _-helices. In each subunit MgAMPPNP binds along the sheet C-edge, and N-acetyl-L-glutamate (NAG) binds near the dyadic axis with its _-carboxilate aligned at short distance from the _-phosphoryl. The structural resemblance with carbamate kinase and sequence alignment suggest that NAGK is the prototype for the amino acid kinase family. Moreover, a large volume of unexplained electron density in this crystal is interpreted as an external, very extended, metal-free AMPPNP molecule that occupies two alternative positions and that makes contacts with the protein exclusively through its _-imidophosphate
PART II. We determine here also the crystal structures of NAGK complexes with MgADP and NAG alone or with the transition-state analog AlF4- and with ADP and sulphate. Comparison of these structures allows to delineate three successive steps during phosphoryl transfer. The transfer occurs in line and is strongly associative, with Lys8 and Lys217 stabilizing the transition state and the leaving group, respectively. Three water molecules play, together with Asp162 and the Mg, crucial structural roles. Two glycine-rich loops are also very important, moving in concert with the ligands. The active site is too narrow to accommodate the substrates without compressing the reacting groups, and this compressive strain appears a crucial component of the catalytic mechanism of NAGK. Initial binding of the two substrates would require a different enzyme conformation with a wider active site, and the energy of substrate binding would be used to change the active center conformation.
In many species, NAGK is the pathway-controlling enzyme and is subject to feedback inhibition by arginine. The arginine-inhibitable NAGK from Pseudomonas aeruginosa has been cloned, overexpressed, purified and crystallized in presence of MgADP and NAG. Prismatic crystals diffract to 2.75 Å resolution with space group P1. Self-rotation function suggest the presence of 3-7 dimers in the unit cell.
Tesis realizada gracias a uan beca de la Fundación Ramón Areces para la realización de tesis doctorales
Peer reviewed